廢液抽吸與細胞培養(yǎng)|流程與方法

什么是廢液抽吸?

廢液抽吸(aspiration/suction)為現(xiàn)代生物學技術中常用的技術，用以移除廢棄液體。生物學中常見的細胞培養(yǎng)，是將真核或原核細胞培養(yǎng)于適宜的培養(yǎng)液(culture medium)及環(huán)境中，使其在受控制的狀態(tài)下生長(growth)及增殖(proliferation)的過程。細胞培養(yǎng)的流程包含解凍細胞、培養(yǎng)(cell culture)、繼代培養(yǎng)(俗稱分盤，cell subculture)及冷凍細胞等步驟。

然而，細胞生長過程中會產(chǎn)生代謝物、細胞碎片等廢棄物影響細胞健康，甚至導致細胞凋亡。因此在細胞培養(yǎng)過程中，需定期更換培養(yǎng)液，而移除舊有培養(yǎng)液、洗滌液的行為，則為廢液抽吸。

真空廢液抽吸裝置(suction system,aspiration system)常見如上圖，主要包含：

真空瓶(vacuum flask)

緩沖瓶(safety bottle)

過濾器(filter)

真空源(vacuum source)

連接并啟動真空源后，細胞培養(yǎng)瓶/皿中的廢液會因壓力差而被抽吸、收集至真空瓶，緩沖瓶則做為防溢裝置使用，以避免廢液被抽吸至真空源內(nèi)。過濾器可使用HEPA濾膜(High Efficiency Particulate Air filter或0.22µm過濾器，以過濾掉廢液及空氣中的粒子、確保抽吸效率。

細胞培養(yǎng)流程

▲細胞培養(yǎng)前，請確認操作環(huán)境符合無菌操作條件，且應避免和細菌實驗共用設備，以防污染。

解凍細胞(thawing cells)：將冷凍細胞以37 oC快速解凍、回溫，以避免細胞損傷。

培養(yǎng)(cell culture)：依據(jù)細胞種類和濃度，將細胞和培養(yǎng)基均勻混合后，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

繼代培養(yǎng)(cell subculture)：當細胞生長至一定程度后，收集細胞，分殖于新的培養(yǎng)基中。

進行繼代培養(yǎng)時，其依細胞種類不同，處理方式可分為以下兩大類：

a.附著型細胞(adherent cell)，又稱貼壁培養(yǎng)、單層培養(yǎng)(monolayer culture)

去除舊培養(yǎng)基廢液

以Phosphate buffered saline(PBS)洗滌細胞一至二次

加入trypsin-EDTA溶液，于37 oC下作用2~20分鐘，使細胞可自培養(yǎng)瓶/皿中脫落

加入含有血清的新鮮培養(yǎng)基中，以終止胰蛋白酶作用

將脫落的細胞及其團塊打散、混合均勻后，收集所有液體

離心后移除上清液，并添加新鮮培養(yǎng)基，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶/皿中進行培養(yǎng)

b.懸浮型細胞(suspension cell)，又稱懸浮培養(yǎng)(suspension culture)

將細胞培養(yǎng)液以1000 rpm離心5分鐘后，吸除上清液

加入適量新鮮培養(yǎng)基，與沉淀細胞混合均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶/皿中進行培養(yǎng)。

冷凍細胞(cryopreservation)：獲得目標細胞株后，將細胞懸浮于含有5~10%DMSO(二甲基亞砜，dimethyl sulfoxide)及30~50%FBS(胎牛血清，F(xiàn)etal Bovine Serum)的新鮮培養(yǎng)液中，以-80 oC或液態(tài)氮等低溫設備保存。

細胞計數(shù)(cell counting)：用以計算細胞濃度，可利用傳統(tǒng)血球計數(shù)器(Neubauer chamber)或自動計數(shù)器，計算細胞濃度可用來判斷目前細胞生長的情況。

廢液抽吸方法的比較

廢液抽吸目前有多種方法可以進行。早期實驗室多利用移液器(pipette)或電動吸管抽吸廢液，然而因為需要重覆抽吸及排除液體，長時間使用下來易造成手部不適及疲勞。除此之外，電動吸管須搭配無菌刻度吸管使用，而現(xiàn)多使用拋棄式吸管排除污染疑慮，因此一次實驗下來通常會產(chǎn)生大量廢棄物，造成環(huán)境負擔。

現(xiàn)代實驗室則普遍會自行購置真空幫浦搭配真空瓶自行組裝，如此會較電動吸管有效率，且設備取得較容易，然而自組式系統(tǒng)常見許多例如：管線配置不良，造成工作環(huán)境混亂、或是玻璃吸管經(jīng)常破裂等安全性上的缺點。

Lafil廢液抽吸系統(tǒng)及BioDolphin廢液抽吸套件主要為生命科學細胞培養(yǎng)或?qū)嶒炦^程中溶液抽吸應用，可直接放置于無菌無塵操作臺(laminar flow)使用。Lafil廢液抽吸系統(tǒng)整合真空源、真空瓶與廢液抽吸套件，提供實驗室一體化解決方案，更比傳統(tǒng)廢液抽吸系統(tǒng)減少一半檯面占用面積，并使用圍籬式平臺固定真空瓶，避免操作者不小心碰觸瓶身而傾倒。

洛科Lafil廢液抽吸系統(tǒng)及BioDolphin廢液抽吸套件

細胞培養(yǎng)實驗室基礎設備

廢液處理與廢棄辦法

含有危險化學品（如氯）之有機廢液應收集至設有適當標示之專用廢液桶，不含危險化學品之其它廢液可一併收集于一般混合廢液桶，廢油則需收集于廢油桶中。細胞培養(yǎng)用的廢液應加入適當濃度的消毒劑，如漂白水(次氯酸鈉Sodium Hypochlorite)，使細胞致死，再倒入水槽或廢液桶。培養(yǎng)皿等生物醫(yī)療相關廢棄物則應置于生物醫(yī)療廢棄物袋中，進行高溫高壓滅菌后以一般廢棄物丟棄，或是請依照我國生物醫(yī)療廢棄物相關規(guī)定處理。

參考資料

Cell Culture Basics:Equipment,Fundamentals and Protocols|Technology Networks

Cell Culture Basics,EU(vanderbilt.edu)

Cell Culture Fundamentals:Safety Aspects of Cell Culture,Sigma-Aldrich

Cell culture protocol,Proteintech

Cell culture|細胞培養(yǎng)，ACE Biolabs

Laboratory Environmental Sample Disposal Information Document,Section 6.0,2010,US EPA

TISSUE CULTURE WASTE DISPOSAL GUIDELINES,2017,Laboratory Safety,THE GEORGE WASHINGTON UNIVERSITY

Tissue Culture Waste Disposal Guide,2022,EHS,Weill Cornell Medicine

行政院環(huán)境保護署，事業(yè)廢棄物貯存清除處理方法及設施標準，環(huán)署循字第1111016706號

細胞繼代培養(yǎng)，生物資源保存及研究中心-BCRC小教室